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鹽酸克侖特羅（瘦肉精）檢測(cè)試劑盒/（瘦肉精）檢測(cè)試劑盒  型號(hào):DP-SRJ

   本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法定量測(cè)定尿、肌肉，肝臟及飼料中的克倫特羅及其他β興奮劑。試劑盒中包括了96個(gè)試驗(yàn)孔包括標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)及所有檢測(cè)用的試劑。如果進(jìn)行定量分析，必須有微孔板酶標(biāo)儀。
概要
     克侖特羅（clenbuterol，CLE）是一種腎上腺受體激動(dòng)劑即神經(jīng)興奮劑，在臨床上用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，被一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖促進(jìn)劑非法使用。其殘留量可導(dǎo)致人體肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，對(duì)消費(fèi)者的健康極有危害。現(xiàn)已被明令禁止用于養(yǎng)殖業(yè)。HPLC或GC-MS一直用作檢測(cè)β興奮劑的方法，但是其前處理步驟費(fèi)用昂貴。酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒則可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)尿，肌肉，肝臟及飼料中的CLE。
測(cè)定原理
     測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)CLE的兔抗體。經(jīng)過(guò)洗滌步驟后，加入CLE酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。CLE與CLE-酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)抗體，沒(méi)有連接的CLE-酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶反應(yīng)底物（過(guò)氧化尿素）和顯色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的顯色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的CLE濃度成反比。
提供的試劑（2-8℃保存）切勿冷凍
每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量（包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔），盒中的材料如下：
       1×96孔板（12條×8孔）包被有兔IgG抗體    
       6×標(biāo)準(zhǔn)液，       (2ml)為分別含0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb 的CLE水溶液
       1×CLE過(guò)氧化物酶標(biāo)記物濃縮溶液     
       1×酶反應(yīng)底物 （6ml）；含有過(guò)氧化尿素
       1×顯色劑         （6ml）;四甲基聯(lián)苯胺
       1×反應(yīng)停止液 （7ml）；1M 硫酸
       1×PBS        (10ml), 用于稀釋CLE-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物濃縮溶液
       1×PBST濃縮液(40ml)，加800ml蒸餾水稀釋，洗板用
樣品處理
    樣品處理方法1
      組織、肉樣（純精肉）、內(nèi)臟樣品的處理方法:
１．稱2克勻漿過(guò)的樣品加入2 mL溶液１(無(wú)色無(wú)味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。
2. 加入6 ml溶液2(淡黃色,具刺激性氣味)，推薦用干凈的衛(wèi)生筷或竹簽攪拌樣品5分鐘；或振蕩15分鐘，使其均勻分布于溶液中。
3．3000g離心10分鐘。
4.  取3ml上清液于干凈平皿中,60℃恒溫箱蒸干(30分鐘左右)；也可在試管中直接水浴加熱蒸干。
5．殘留物用1ml 溶液2 (無(wú)色無(wú)味) 沖洗溶解。
6．3000g離心10分鐘。
7．取清亮中間部分50ul直接加樣, ELISA進(jìn)行分析。
注：如果不慎將溶液弄到皮膚上，請(qǐng)立即用７５％的醫(yī)用酒精棉花擦拭，并用清水沖洗。切勿飲用及濺入眼睛。
 
     樣品處理方法2                  （更快速）
1、稱2克勻漿過(guò)的樣品加入2 mL溶液１(無(wú)色無(wú)味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。
2、加入4mL溶液2 (淡黃色,具刺激性氣味)，強(qiáng)烈振蕩，肉樣約2分鐘，組織約6分鐘。
3、3000g離心5分鐘。
4、取1 ml上清液于干凈平皿中，70℃~80℃恒溫箱蒸干(約需5分鐘左右)。或用電吹風(fēng)，只需3分鐘。
5、殘留物用0.5 ml 溶液3 (無(wú)色無(wú)味) 沖洗，將底部白色殘留物全部洗入溶液。
6、取洗脫液50ul作檢測(cè)用。
 
酶標(biāo)免疫分析程序
1. 測(cè)定之前注意事項(xiàng)
   a)  使用之前將所有試劑回升至室溫20-25℃
   b)  使用之后立即將所有試劑放回2-8℃
   c)  在使用中不要讓微孔干燥
   d)  在ELA分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是ELA測(cè)定程序中的要點(diǎn)
   e)  在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板
2.酶標(biāo)記物與微孔板條
   a) CLE- 酶標(biāo)記物 提供的CLE- 酶標(biāo)記物為濃縮液。由于稀釋的酶標(biāo)記物穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實(shí)際需用量的酶標(biāo)記物1：14稀釋（1μl酶標(biāo)液加14μlPBS）。在吸取濃縮液之前，要仔細(xì)地振搖，剩余的仍放置2-8℃保存。
   b)微孔板條  取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板用膠帶封好，放進(jìn)原袋中重新密封，4℃或-20℃保存，謹(jǐn)防受潮。
3. 標(biāo)準(zhǔn)液    提供的CLE標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb(ng/ml)
4. 測(cè)定程序（室溫25℃條件下操作）
   a) 剪開(kāi)鋁箔袋，將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。加入20μl的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔中。如果微孔板條一次實(shí)驗(yàn)用不完，放回原鋁箔袋中封緊，最好再套一個(gè)塑料自封袋夾緊后4℃或-20℃保存，切忌受潮。
   b) 加入100μl稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部，25℃孵育30分鐘（推薦使用恒溫箱）。
   c) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250μl PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作兩次。每次洗板應(yīng)加入洗液后等2分鐘再倒掉。推薦使用洗瓶洗板，這樣可加快速度，避免板條間的孵育時(shí)間不一致而產(chǎn)生OD值的差異。
   d) 反應(yīng)底物與顯色試劑以1：1混合后加入100μl到微孔中，充分混合并在25℃暗處孵育15分鐘。
   e) 加入50μl反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450nm 處測(cè)量吸光度值，必須在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
結(jié)果
     所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比的形式給出吸光度值。
 
               標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）
              ----------------------- ×100 =  %吸光度值
                    0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值
 
計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)CLE濃度（ng/g,或ng/ml）的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.2-2ng/g(ppb)范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（ng/g, 或ng/ml）可以從校正曲線上讀出。
靈敏度
     克倫特羅測(cè)定試劑盒的平均檢測(cè)下限約為0.1ng/g（0.1ppb）。
特異性
   與克倫特羅類似物的交叉反應(yīng)：
      克倫特羅(Clenbuterol)             100%                              
      溴布特羅(brombuterol)            110%
      塞布特羅(cimbuterol )              40%                           
      馬噴特羅(mapenterol)              17%
      馬布特羅(mabuterol)               16%                                    
      沙丁胺醇(salbutamol)               9%
      妥布特羅(tulobuterol)               2%                                                                      特布他林(terbutalin)                 2%
      萊克多巴胺                             <1%                      
     異丙腎上腺素(Isoproterenol)       <1%
      腎上腺素(Adrenalin )                <1%                                  
     去甲腎上腺素(Noradrenalin)         <1%
 
回收率
       回收率為90%±15%